Is teicníc eagarthóireachta géanóim tríú glúin í CRISPR: Rinne CRISPR réabhlóid ar an domhan

Is teicníc eagarthóireachta géanóim tríú glúin í athchraoltaí pailindrómacha gearra idirspásáilte go rialta (CRISPR) a d'athraigh an domhan go hiomlán lena torthaí ard-tréchur. Úsáideadh í chun galair agus ionfhabhtuithe bitheolaíocha éagsúla a chóireáil. Tá córais CRISPR/Cas9 ag baictéir agus procarótaigh eile (amhail archaea) freisin chun cosaint a dhéanamh i gcoinne fagaí. Tuairiscíodh gur féidir le straitéisí bunaithe ar CRISPR/Cas9 fás agus dul chun cinn ailse chíche trí-dhiúltach (TNBC) a chosc trí dhíriú ar ghéinte friotaíochta, trascríobh agus rialáil eipiginéiteach a d'fhéadfadh a bheith athraithe. Féadfaidh na hidirghabhálacha teiripeacha seo cabhrú le dul i ngleic le fadhbanna dúshlánacha amhail friotaíocht drugaí a breathnaíodh fiú i TNBC. Faoi láthair, úsáidtear modhanna éagsúla chun CRISPR/Cas9 a sheachadadh chuig cealla spriocdhírithe, amhail modhanna fisiceacha (micrea-instealladh, leictreaphórú agus modhanna hidridinimiciúla), víreasacha (víreas agus lentivíreas a bhaineann le hadenó) agus neamh-víreasacha (liposóim agus nana-cháithníní lipid). Cé gur forbraíodh samhlacha éagsúla chun cúiseanna móilíneacha TNBC a imscrúdú, cuireann easpa modhanna íogaire agus spriocdhírithe chun uirlisí eagarthóireachta géanóim a sheachadadh in vivo teorainn lena bhfeidhm chliniciúil. Mar achoimre, déanann an t-athbhreithniú seo scrúdú cuimsitheach ar dhul chun cinn, ar dhúshláin, ar theorainneacha agus ar ionchais na cóireála CRISPR/Cas9 le haghaidh TNBC bunaithe ar fhianaise atá ann cheana féin. Leagaimid béim freisin ar an gcaoi a bhféadfadh an teaglaim d’intleacht shaorga agus d’fhoghlaim meaisín feabhas a chur ar straitéisí CRISPR/Cas9 i gcóireáil TNBC.
Is sainairíonna ailse deighilt neamhrialaithe cille, cur isteach ar phointí seiceála timthriall cille, agus sócháin i ngéinte coisctheacha meall (TSGanna) (Matthews et al., 2022). I measc na gcineálacha éagsúla ailse, is í ailse chíche an cineál ailse is coitianta i measc na mban agus tá ráta ard mortlaíochta aici ar fud an domhain (Waks agus Winer, 2019). Is galar ilchineálach í ailse chíche a bhfuil tréithe éagsúla aici, amhail gnéithe histolacha agus bitheolaíocha, cur i láthair cliniciúil agus iompar, agus freagairt ar chóireáil (Weigelt et al., 2010). Soláthraíonn aicmiú ailse chíche léargas beacht maidir le diagnóis ailse chíche agus prognóis meall. Is é úsáid bithmharcóirí coitianta agus gnéithe clinice-phaiteolaíocha an príomhchritéar maidir le haicmiú ailse chíche (Tsang agus Tse, 2019). Bíonn tionchar ag go leor fachtóirí ar an prognóis agus ar an bhfreagairt ar chóireáil ailse chíche, lena n-áirítear láithreacht gabhdóra estrogen (ER), gabhdóra prógesteróin (PR), gabhdóir fachtóra fáis eipideirmeach daonna 2 (HER2/neu), agus grád histolach, cineál meall, agus grád. méid agus meiteastáis nód limfe (Al-Tubaiti, 2020). Aithníodh cúig fhochineál móilíneacha intreach ailse chíche, lena n-áirítear luminal A, luminal B, HER2-saibhrithe, basal-like, agus claudin-low (Prat et al., 2015). Is fochineál móilíneach ailse é TNBC nach léiríonn gach ER, PR, agus HER2 (Yin et al., 2020). Tá na gnéithe paiteolaíocha seo bainteach le TNBC, rud a dheimhníonn a dhul chun cinn tapa agus a nádúr níos ionsaithí ná aon chineál eile ailse chíche (Feng et al., 2018). Ina theannta sin, bhain Peru et al (2000) úsáid as teicneolaíocht micrea-araí chun ailse chíche a ath-aicmiú agus cúig fhochineál intreach ailse chíche a aithint (Cadenas, 2012). Is fochineál ailse chíche é ailse chíche basal-like a bhfuil feinitíopa trí-dhiúltach aige agus a bhaineann le dul chun cinn tapa. Ba chóir a thabhairt faoi deara go minic a dhéantar diagnóis mhícheart ar gach ailse chíche basal-chosúil mar TNBC, ach níl ach 77% díobh TNBC; I gcodarsnacht leis sin, tá 71–91% de TNBC basal-chosúil, rud a léiríonn go bhfuil forluí idir an dá chineál ailse chíche seo agus go léiríonn siad aicmithe difriúla (Wang D.-Y. et al., 2019). Cruthaíonn sé seo gá le héagsúlacht TNBC a shainiú chun prognóis a shoiléiriú agus freagairtí féideartha ar chóireálacha reatha agus amach anseo a aithint. Ina theannta sin, is ionann TNBC agus 15–20% de na cásanna ailse chíche go léir agus tá sé níos coitianta i measc na mban faoi bhun 50 bliain d'aois. Tuairiscíodh sócháin BRCA1 nó BRCA2 i thart ar 20% de chásanna TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Léirigh staidéir freisin go bhfuil micri-thimpeallacht imdhíonachta ar leith ag TNBC lena n-áirítear leibhéil arda fachtóirí fáis endothelial soithíoch, macrófagaigh a bhaineann le meall (TAManna), limficítí insíothlaithe meall (TILanna), agus móilíní eile a bhfuil baint acu le fás agus imirce meall. Dá bhrí sin, tá tuiscint ar mhicri-thimpeallacht TNBC ríthábhachtach dá prognóis agus dá chóireáil (Fan agus He, 2022).
Chun prognóis TNBC a mheas agus cóireáil éifeachtach a chinntiú, tá tábhacht le diagnóis chruinn, bunaithe go príomha ar imdhíoneolaíocht (IHC) chun ER, PR agus HER2 a bhrath, agus mamagrafaíocht chun neoplasmaí cíche a bhrath. Mar sin féin, ní féidir le mamagrafaíocht gnéithe intratumoral amhail neacróis agus fibróis a léiriú go leordhóthanach (Deepak Singh et al., 2021). Ós rud é go gcuireann drochphrognóis agus drochdhiagnóis cosc ​​​​ar dhochtúirí na cógais chearta a fhorordú (Chaudhary, 2020), úsáidtear straitéisí éagsúla chun cúram a fheabhsú d'othair le TNBC. Faoi láthair, úsáidtear dhá dhruga, doxorubicin agus ciclofosfamíd, in othair le TNBC agus tá torthaí maithe léirithe acu. Ina theannta sin, úsáidtear drugaí platanam eile, amhail carboplatin agus cisplatin (Sikov et al., 2015). Ina theannta sin, úsáideadh coscairí PARP amhail Olaparib, Velaparib, agus PF-01367338 mar dhrugaí ceimiteiripe féideartha chun TNBC a chóireáil (Ishino et al., 2018). Ós rud é gur tuairiscíodh go bhfuil baint ag conairí comharthaíochta Wnt/b-Catenin, NOTCH, agus Hedgehog le tarlú agus le dul chun cinn TNBC, d'fhéadfadh sé gur straitéis thábhachtach í díriú ar dhrugaí chuig na conairí seo (Aysola et al., 2013). Cé gurb iad obráid, radaiteiripe agus ceimiteiripe príomhchóireáil TNBC inniu, tá dul chun cinn suntasach déanta i bhforbairt cóireálacha nua lena n-áirítear teiripe spriocdhírithe, imdhíoneolaíocht, uirlisí éagsúla eagarthóireachta géine a bhaineann le CRISPR amhail Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, príomh-eagarthóireacht, agus teiripe géine spriocdhírithe ar CRISPR/Cas9. Díreoimid anseo ar uirlisí éagsúla eagarthóireachta géine a bhaineann le CRISPR a úsáidtear i gcóireáil TNBC. Ina measc, tá aird fhorleathan faighte ag CRISPR/Cas9.
Is malairt innealtóireachta géiniteach den phróitéin Cas9 é Cas9n, ar a dtugtar niccase Cas9 freisin, a dhíorthaítear ón gcóras eagarthóireachta géanóim CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Ina fhoirm bhunaidh, tá dhá fhearann ​​núicléáise sa phróitéin Cas9: RuvC agus HNH, agus is é an phríomhfheidhm atá acu ná scoilteadh an dá shnáithe DNA. Mar sin féin, i Cas9n, déantar ceann de na fearainn núicléáise, HNH, a mhúchadh go géiniteach agus éiríonn sé neamhghníomhach. Dá bhrí sin, fanann fearann ​​HNH Cas9n neamhfheidhmiúil. Ní fhanann ach fearann ​​RuvC gníomhach, rud a ligeann do Cas9n briseadh a ghearradh nó a chruthú ar shnáitheanna DNA aonair (Trevino agus Zhang, 2014). I gcomparáid le Cas9, is féidir le Cas9n éifeachtaí lasmuigh den sprioc a laghdú go héifeachtach agus meicníochtaí deisiúcháin cille a fheabhsú go cruinn. Is féidir Cas9n a úsáid chun fadhbanna éagsúla a réiteach, amhail briseadh a chruthú ag suíomhanna sonracha i DNA dé-shnáithe. Chun na críche seo, comhcheanglaíodh dhá mhóilín Cas9n agus úsáideadh iad le chéile (Yee, 2016). Is cíneas próitéine gníomhachtaithe mitogen é cíneas measctha líneála 3 (MLK3) a fheidhmíonn mar rialtóir lárnach le linn meiteastáis TNBC (Cronan et al., 2012).
Is féidir le MLK3 ilchonairí comharthaíochta a ghníomhachtú as a dtagann meiteastáis TNBC. Mar shampla, rialaíonn an bealach cínáis N-críochfoirt c-Jun (JNK) soghluaisteacht cille agus díghrádú maitrís eachtarcheallach, agus gníomhaíonn MLK3 an bealach JNK, rud a fheabhsaíonn soghluaisteacht cille agus a thugann airíonna ionracha (Rattanasinchai agus Gallo, 2016). Rialaíonn MLK3 EMT freisin. Chun seo a dhéanamh, gníomhaíonn sé fachtóirí trascríobh iartheachtach amhail Seilide, Seilide agus Casadh. Cuireann na fachtóirí seo cosc ​​ar léiriú marcóirí eipitéiliacha agus cuireann siad léiriú marcóirí meiseinceimeacha chun cinn, rud a fhágann go bhfaightear feinóip meiteastáis (Casalino et al., 2023). Breathnaíodh go bhfuil ról ag MLK3 in athmhúnlú ECM agus gníomhachtú próitéáisí amhail maitrís meatallópróitéináisí (MMPanna) a dhíghrádaíonn an ECM. Éascaíonn sé seo ionradh cille meall agus scaipeadh chuig suíomhanna i bhfad i gcéin (Katari et al., 2019). Dá bhrí sin, léirigh staidéir roimhe seo go bhfuil ról ríthábhachtach ag MLK3 i TNBC. Bhain Rattanasinchai agus Gallo úsáid as samhlacha TNBC chun ról MLK3 a imscrúdú agus fuair siad amach go gcuireann sé forbairt ailse chun cinn trí chonairí comharthaíochta sonracha. Bhain siad úsáid as CRISPR/Cas9n chun MLK3 a chur in eagar agus thug siad faoi deara laghdú suntasach ar mheiteastáis TNBC (Rattanasinchai agus Gallo, 2016).
Is foirm dhíorthach modhnaithe den phróitéin Cas9 é dCas9, ar a dtugtar Cas9 neamhghníomhach go minic. Murab ionann agus Cas9 gníomhach, níl gníomhaíocht endónúicléáise ag dCas9, rud a fhágann nach bhfuil sé in ann briseadh dúbailte-shnáithe DNA a spreagadh. Dá bhrí sin, is féidir dCas9 a úsáid chun réigiúin shonracha den ghéanóm a spriocdhíriú go beacht gan aon athruithe ná modhnuithe ar an seicheamh DNA (Wang et al., 2016). I dCas9, déantar dhá phróitéin endónúicléáise, RuvC agus HNH, a dhíghníomhachtú trí iarmhair aimínaigéid thábhachtacha a chosc. (Richter et al., 2016). In ainneoin a easpa gníomhaíochta scoilte DNA, tá roinnt rólanna tábhachtacha ag dCas9 i dtaighde géiniteach agus i mbiteicneolaíocht. Mar shampla, ceadaíonn sé léirshamhlú ar réigiúin shonracha den ghéanóm, éascaíonn sé rialáil trascríobh, agus cuireann sé modhnuithe eipiginéiteacha chun cinn (Brocken et al., 2018).
Tá ról sonrach agus ríthábhachtach ag an bhfachtóir trascríobh ZEB1 (sinc finger E-box connecting homeobox 1) i idirghabháil a dhéanamh idir an t-aistriú eipitéiliach-meiseanchímealach (EMT), próiseas ceallach a tharlaíonn le linn forbairt suthach, deisiú fíocháin, agus dul chun cinn ailse. Baineann sé le claochlú cealla eipitéiliacha ina gcealla meiseinchímealacha, rud a fhágann athruithe i moirfeolaíocht cille, soghluaisteacht, ionrachas, etc. (Wu et al., 2020). Cuireann ZEB1 cosc ​​ar ilmharcóirí eipitéiliacha, amhail E-cadherin agus Occludin, atá freagrach as greamaitheacht cille-le-cill agus polaraíocht cealla eipitéiliacha i TNBC a chothabháil (Moreno-Bueno et al., 2008). Ina theannta sin, gníomhaíonn ZEB1 marcóirí áirithe amhail N-cadherin, vimentin agus fibronectin (Konradi et al., 2014) agus rialaíonn sé géinte atá bainteach le hathmhúnlú cíteashnáithíneach amhail Rho GTPases agus maitrís metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), ina theannta sin, bíonn tionchar aige ar chonairí comharthaíochta éagsúla amhail fachtóir fáis claochlaitheach-β (TGF-β), comharthaíocht Wnt, etc., rud a chuireann ionradh meall agus meiteastáis chun cinn i TNBC (Chen et al., 2016). Léiríonn staidéir iomadúla agus fianaise eolaíoch go bhfuil acmhainneacht mhór ag ZEB1 mar ghníomhaire luachmhar chun TNBC a bhrath agus idirghabháil theiripeach a dhéanamh ina leith. I staidéar le déanaí, bhain Waryah et al. úsáid as samhail TNBC agus bhain siad amach cosc ​​iomlán ar ZEB1 le dCas9. Dá bhrí sin, breathnaíodh sainiúlacht an-ard agus cosc ​​beagnach iomlán ar ZEB1 i ndálaí in vivo (Waryah et al., 2023).
Is uirlis eagarthóireachta géine é CRISPR/Cpf1 ar a dtugtar CRISPR/Cpf1. Díorthaítear é ón gcóras CRISPR/Cas, áit a dtagraíonn an téarma Cas12 do phróitéin 12 a bhaineann le CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), atá go hiomlán cosúil le Cas9. Is é an t-aon difríocht ná go bhfuil an próitéin Cas12 ann. I gcomparáid le Cas9, tá roinnt feidhmeanna uathúla ag Cas12 amhail foircinn ghreamaitheacha a ghiniúint le linn an phróisis eagarthóireachta géine, ach gineann Cas9 foircinn mhaola (Wang et al., 2021). Cuireann an airí seo de chuid Cas12 lena theicneolaíocht ionramhála DNA shonrach. Mar phróitéin atá in ann DNA sprice a aithint agus a ghearradh go beacht, tá solúbthacht urghnách aige, rud a fhágann gur uirlis éifeachtach é le haghaidh réimse feidhmeanna, lena n-áirítear eagarthóireacht géine (Pickar-Oliver agus Gersbach, 2019).
Cosúil le malairtí eile de CRISPR, tá CRISPR/Cas12 in ann géinte i TNBC a dhíchur nó a ghníomhachtú freisin, ag díriú ar ghéinte a bhfuil ról tábhachtach acu ina phaitiginéis nó ina fhreagairt ar chóireáil (Yang agus Zhang, 2023). Chun an próiseas seo a chur i gcrích, forbraíodh RNA treorach (gRNA) a threoraíonn Cas12 chuig an ngéin sprice. Chomh luath agus a cheanglaíonn Cas12 lena sprioc, tugann sé isteach briseadh dúbailte-shnáithe sa DNA agus gníomhaíonn sé meicníochtaí deisiúcháin DNA. Le linn an phróisis deisiúcháin, féadfar núicléatídí míchearta a ionchorprú, rud a fhágann sócháin géine agus cailliúint feidhme (Zhang et al., 2021a). Ina theannta sin, úsáideadh leagan feabhsaithe den einsím Cas12 (ar a dtugtar dCas12) chun géinte a ghníomhachtú freisin. Trí é a chomhcheangal le gníomhachtóir trascríobh, is féidir géinte áirithe a spreagadh, agus iad a ghníomhachtú dá bharr. Tá acmhainneacht mhór ag an teicneolaíocht seo chun gníomhachtú géinte coisctheacha meall a chur chun cinn (Sultan et al., 2022).
Is teicneolaíocht eagarthóireachta géanóim nuafhorbartha agus thar a bheith den scoth í an phríomh-eagarthóireacht. Tá sí in ann DNA orgánaigh a mhodhnú go beacht (Chen agus Liu, 2023). Baintear príomh-eagarthóireacht amach trí chomhtháthú dhá phríomhchomhpháirt: einsím CRISPR/Cas9 modhnaithe agus transcriptáis droim ar ais. Is é ról an einsím CRISPR/Cas9 díriú go roghnach ar shuíomhanna beachta sa ghéanóm, agus cuidíonn transcriptáis droim ar ais leis an DNA a mhodhnú go críochnúil ag an suíomh sprice (Hassan et al., 2021). Sa mheicníocht eagarthóireachta tosaitheoirí, baineann an chéad chéim le cruthú RNA treorach eagarthóireachta tosaitheoirí (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Tá an seicheamh sprice agus an teimpléad RNA ann a fhreagraíonn don suíomh eagarthóireachta atá ag teastáil sa DNA sprice. Ansin tugtar an pegRNA isteach sna cealla sprice mar aon le núicléáis eagarthóireachta tosaitheoirí (PE2). Is próitéin chomhleá é PE2 atá comhdhéanta d'einsím Cas9, transcriptáis droim ar ais, agus oiriúntóir eagarthóireachta tosaitheoirí (Martín-Alonso et al., 2021). Laistigh den chill, déanann coimpléisc pegRNA agus PE2 cuardach ar an DNA sonrach ar mian leo a mhodhnú. Gearrann an einsím Cas9 DNA agus cruthaíonn sé teimpléad ina bhfuil snáitheanna aonair (Choi et al., 2022). Úsáideann trascríbhinn droim ar ais an teimpléad seo chun an DNA a ullmhú le haghaidh eagarthóireachta. Chomh maith le DNA a chóipeáil, cuirtear treoracha maidir le teimpléad an RNA a chur in eagar san áireamh freisin. Ar deireadh, úsáidtear an snáithe DNA nuachruthaithe mar theimpléad chun an briseadh sa DNA a dheisiú, rud a fhágann go bhfuil seicheamh DNA athraithe ina bhfuil an modhnú atá ag teastáil (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Is féidir le meicníochtaí eagarthóireachta tosaitheoirí sócháin fhorleathana i ngéinte a bheith mar thoradh orthu. Is féidir leis díriú ar shócháin phointe, ar ionchur, ar scriosadh, agus fiú ar athsholáthar géine (Anzalone et al., 2019; Chen agus Liu, 2023). Cuireann príomh-eagarthóireacht roinnt buntáistí ar fáil thar theicneolaíochtaí eagarthóireachta géanóim roimhe seo. Áirítear leis seo cruinneas méadaithe, éifeachtaí lasmuigh den sprioc laghdaithe, agus an cumas DNA a chur in eagar gan brath ar bhriseadh dúbailte-snáithe DNA (Anzalone et al., 2020).
Forbraíodh teicneolaíocht CRISPR/Cas9 ar dtús chun baictéir a chosaint ar aistriú plasmíde agus ionfhabhtú faga agus athúsáideadh í ina dhiaidh sin mar uirlis spriocdhírithe DNA bunaithe ar RNA éifeachtach le haghaidh eagarthóireacht géanóim (Jiang agus Doudna, 2017). Ina theannta sin, tuairiscíodh go bhfuil an córas CRISPR/Cas9 i láthair i 50% agus 87% de ghéanóim bhaictéaracha agus arcaeal, faoi seach (Ishino et al., 2018). Is uirlis fhéideartha é CRISPR/Cas9 chun aon seicheamh géiniteach neamhghnácha a scriosadh, a chur isteach agus a cheartú ag baint úsáide as modhanna in vivo agus in vitro (Sabit et al., 2021). Thairis sin, tá sé léirithe gur cuid den chóras imdhíonachta oiriúnaitheach é CRISPR/Cas9 mar gheall ar a shonrúlacht do ghéinte sprice spéise (Chen agus Zhang, 2018).
Is éard atá i CRISPR/Cas9 ná Cas9 agus RNA treorach aonair (sgRNA). Is einsím é Cas9 atá comhdhéanta de chomhpháirteanna próitéine iolracha. Ina theannta sin, tá airíonna struchtúracha agus comhréireacha uathúla ag Cas9 (Pacesa et al., 2022) toisc go bhfuil dhá lóib ann: aitheantas (REC) agus núicléáis (NUC). Tá lóib an REC roinnte ina thrí réigiún: REC1, REC2, agus héilicsí droichid (Cromwell et al., 2018). Tá trí lóib san NUC, eadhon RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH agus fearann ​​idirghníomhaíochta an mhóitíf in aice láimhe protospacer (PAM) (Fíor 1) (Song et al., 2016). Tá dhá chomhpháirt san sgRNA, lena n-áirítear RNA CRISPR (crRNA) agus RNA beag tras-chódaithe (RNA rianaithe) (Fíor 1). Ceanglaíonn an sgRNA an próitéin Cas9 le connexins chun coimpléasc gníomhach a fhoirmiú, ar a dtugtar an coimpléasc éifeachtóra freisin (Richter et al., 2012). Is péire bonn 18–20 núicléatíde é crRNA a bhfuil ról ríthábhachtach aige i seichimh DNA sprice a aithint. Ina theannta sin, péireálann crRNA leis an DNA sprice, agus feidhmíonn tracrRNA mar scafall don núicléáis Cas9 chun an DNA sprice a cheangal (Manghwar et al., 2019). Ar an láimh eile, tá 3 núicléatíde sa seicheamh PAM, rud a dhearbhaíonn, a shonraíonn agus a idirghabhálann ceangal an choimpléasc éifeachtóra le DNA. Tá gníomhaíocht chatalaíoch ag fo-aonaid choimpléasc próitéine Cas9 RuvC agus HNH (Richter et al., 2012; Asmamaw agus Zawdie, 2021). Scoilteann fearann ​​núicléáis HNH an fho-aonaid Cas9 an snáithe DNA a bhaineann leis an crRNA. Scoilteann fearann ​​núicléáise RuvC snáitheanna DNA eile agus gintear briseadh snáithe dúbailte (DSBanna), agus ina dhiaidh sin gníomhaítear dhá mheicníocht dheisiúcháin briste DNA éagsúla (Jiang agus Doudna, 2017) (Fíor 1).
Fíor 1. Forbhreathnú ar CRISPR/Cas9 (A). Comhpháirteanna an chórais CRISPR/Cas9: (i). Tá endónúicléáis Cas9 freagrach as an seicheamh DNA sprice a ghearradh, (ii) RNA treorach aonair (sg) a eascraíonn as comhleá crRNA agus chiméaraí tra-crRNA. (dhá cheann). Cuimsíonn Cas9 roinnt comhpháirteanna ar nós Rec I, Rec II, lóib NUC (is fo-chomhpháirteanna iad HNH agus Ruv C) agus fearann ​​idirghníomhaíochta PAM (C) le feidhmeanna comhfhreagracha. Scoilteann an coimpléasc próitéine CRISPR/Cas9 seichimh DNA i bhfoirmeacha neamh-chomhlántacha agus comhlántacha (D). Déanann CRISPR/Cas9 an géanóm a chur in eagar i dtrí chéim: aithint, gearradh agus deisiú. Treoraíonn an sg-RNA deartha Cas9 agus aithníonn sé an seicheamh atá ag teastáil tríd an gcomhpháirt chomhlántach crRNA. Aithníonn Cas9 an seicheamh PAM ag 5′-NGG-3′ agus leáíonn sé an DNA, ag foirmiú hibrideach DNA-RNA agus ag gníomhú scoilteadh. Scoilteann fearann ​​HNH Cas9 an snáithe comhlántach, agus scoilteann fearann ​​RuvC an snáithe neamh-chomhlántach. Déanann CRISPR/Cas9 dsDNA a dheisiú trína bhriseadh ar dhá bhealach: ceangal deiridh neamh-homalógach (NHEJ) agus deisiú dírithe ar homalógacht (HDR). Déanann NHEJ DNA dé-shnáithe a dheisiú in éagmais DNA homalógach coigríche trí phróiseas einsímeach, meicníocht atá seans maith go dtarlóidh earráidí ar féidir léi seichimh DNA randamacha a chur isteach nó a bhaint. Tá HDR an-sonrach agus éilíonn sé teimpléid DNA homalógacha.
I measc na gconairí deisiúcháin atá á n-idirghabháil ag CRISPR/Cas9 tá meicníochtaí deisiúcháin neamh-homalógacha (NHEJ) agus deisiúcháin atá dírithe ar homalógacht (HDR). Is cosán seans maith earráide é NHEJ toisc go mbaineann sé le hionchur nó scriosadh agus nach dteastaíonn aon phatrún uaidh le linn an mheicníocht deisiúcháin. Úsáideann sé núicléatídí randamacha chun próitéiní caighdeánacha a ghiniúint (Abbasi et al., 2021). Tá ceithre choimpléasc sa chóras deisiúcháin seo amhail an coimpléasc KU, an coimpléasc próitéine tras-chomhlántach cineál 4 (XRCC-4), an einsím próiseála deiridh DNA, agus an cínáis próitéine DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Tá dhá fho-aonad sa phróitéin choimpléasc KU, Ku 70 agus Ku 80, agus tá ról tábhachtach aici i meicníocht an NHEJ, ós rud é go gcuirtear tús leis an meicníocht deisiúcháin trí cheangal dhá fho-aonad (Ku 70 agus Ku 80) le foircinn mhaola nó beagnach maola an DNA sprice (Abbasi et al., 2021), ag feidhmiú mar scafall chun fachtóirí eile a bhaineann le NHEJ a earcú chuig an láthair díobhála (Yang et al., 2020). Tá XRCC-4 agus ligáis DNA comhdhéanta de 334 agus 911 aimínaigéad, faoi seach, agus spreagann an coimpléasc ligáis IV XRCC4-DNA ceangal foircinn DNA (Chatterjee et al., 2015). Is einsím próiseála foircinn DNA é einsím próiseála foircinn DNA, ar a dtugtar polainiúicléatíde kinase 3′-fosfáit freisin. Is féidir leis an ngrúpa 3′P a bhaint as DNA agus an grúpa 5′OH a fhosfarail le linn deisiúcháin DSB. Baineann sé freisin le deisiú bristeacha aon-snáithe (SSBanna) ag baint úsáide as an gcosán deisiúcháin SSB (Chatterjee et al., 2015). Is cíneas próitéine atá ag brath ar DNA é an cíneas próitéine DNA-PKcs atá comhdhéanta d'fho-aonad catalaíoch de na teaghlaigh PIKKanna (cínáisí gaolmhara le fosfatidilinositol 3-cínáis) agus ataxia telangiectasia mutated (ATM), chomh maith le ATRanna a bhaineann le ATM agus Rad3, bristeacha snáithe (DSBanna) agus bristeacha aon-snáithe (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
Is meicníocht deisiúcháin níos cruinne agus níos oiriúnaí é HDR toisc go ndéantar an fhaisnéis a chóipeáil ag baint úsáide as an bhfoirm shlán den déphléacs DNA homalógach, cé go n-éilíonn sé láithreacht crómatídí deirfiúracha. Tarlaíonn sé seo le linn chéim S/G2 de thimthriall cille mamaigh. Tarlaíonn HDR den chuid is mó i speicis giosta, ach tá NHEJ ríthábhachtach i mamaigh (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Taispeántar an mheicníocht deisiúcháin iomlán i bhFíor 1.
Ós rud é gur neamhghnáchaíochtaí géiniteacha agus eipiginéiteacha is cúis le TNBC, d’fhéadfadh sé gur cur chuige teiripeach réasúnta é ceartú neamhghnáchaíochtaí géanómacha/eipiginéiteacha urchóideacha ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 (Chen et al., 2019). Ina theannta sin, d’fhéadfadh tréithe uathúla cealla ailse a bheith i gceist le roinnt fachtóirí trascríobh a bhfuil baint acu le rialáil trascríobh cille-shonrach, rud a thugann le fios gur cur chuige den scoth é rialáil trascríobh le haghaidh cóireála ailse (Drost et al., 2017). Is féidir le leas a bhaint as na gnéithe móilíneacha seo de meall, amhail lochtanna géiniteacha, eipiginéiteacha agus trascríobhacha, chun drugaí a fhorbairt torthaí cliniciúla a fheabhsú agus costais scagthástála a laghdú. Is uirlis eagarthóireachta géine ionchasach é CRISPR ar féidir leis spriocanna géanómacha is cúis le hailse a bhrath agus a aithint ní hamháin, ach is féidir é a úsáid freisin chun oncogenes i gcealla daonna a chur in eagar, a chosc agus a mhodhnú go heipiginéiteach (Tábla 1) (Ahmed et al., 2021). Rinneadh roinnt scagthástálacha CRISPR chun géinte a bhaineann le coscairí meall, oncogenes agus friotaíocht drugaí a lorg. Léirítear i bhFíor 2 úsáid CRISPR/Cas9 chun oncogéine éagsúla TNBC a chur in eagar.
Fíor 2. Eagarthóireacht ghéine ar oncogéine TNBC éagsúla ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 as a dtagann laghdú ar fhás meall agus ar mheatastáis. Áirítear leis na oncogéine seo CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 agus CXCR7, Crypto1, ROR1 agus ST8SIA, a bhfuil baint acu le tarlú agus le meiteastáis TNBC.
Tá baint ag imirce cealla ailse, ionradh, agus aistriú eipitéiliach-meiseanchímeach (EMT) le ITGA9. Léirigh staidéir roimhe seo gur príomhimreoir é ITGA9 i gconair Notch agus go bhfuil ról suimiúil aige i meiteastáis rhabdomyosarcoma (Molist et al., 2020). Ina theannta sin, fuarthas go raibh dlúthbhaint ag ITGA9 le prognóis othar i roinnt cineálacha meall, lena n-áirítear ailse chíche (Wang Z. et al., 2019). Ina theannta sin, léirigh anailís bhithfhaisnéise ar ITGA9 go raibh a léiriú i TNBC i bhfad níos airde ná i bhfochineálacha eile ailse chíche. Tá baint ag leibhéil arda ITGA9 le meiteastáis meall agus athiompaithe in othair TNBC. Mar thoradh ar bhrú amach ITGA9 ag CRISPR/Cas9, bhí airíonna cosúil le gaschealla ailse (CSC), angiogenesis meall, fás meall, agus meiteastáis laghdaithe trí dhíghrádú β-catenin a chur chun cinn i TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Is ball den teaghlach TGF-β é Crypto-1 agus tá sé ríthábhachtach le haghaidh suthghinéis luath, cothabháil gascheall, agus meiteastáis ailse (Ishii et al., 2021). Ar a dtugtar Tdgf-1 freisin, is próitéin chomharthaíochta oncogenic atá ancaire GPI é atá bainteach le rialáil fhoirmiú an stríoca phrímitiúil, an mheisideirm agus an endoderm, chomh maith le bunú neamhshiméadrachta clé/deas i bhforbairt orgán coirp le linn suthghinéis (Zhang et al., 2021b). Ina theannta sin, tá sé léirithe go bhfuil baint ag Cripto-1 le haistriú eipitéiliach-meiseanchímealach (EMT) mar mharcóir gascheall (Zhang et al., 2021b). Tá EMT ríthábhachtach ní hamháin do phróisis éagsúla amhail forbairt suthach, fibróis agus cneasú créachta, ach freisin le haghaidh ionradh agus meiteastáis ailse. Ina theannta sin, tá sé léirithe go n-idirghníomhaíonn Cripto-1 le ceithre ghabhdóir Notch agus go bhfeabhsaíonn sé a n-aibiú iar-aistriúcháin (Brandstadter agus Maillard, 2019). Is eol go bhfuil baint ag an gconair chomharthaíochta Notch le cothabháil cealla ailse chíche daonna. Léirigh staidéir go gcuireann cnagadh amach Crypto-1, atá á mheánú ag CRISPR/Cas9, cosc ​​ar fhás agus ar mheiteastáis ailse. Dá bhrí sin, d'fhéadfadh Crypto-1 a bheith ina sprioc theiripeach thábhachtach do TNBC (Castro et al., 2015).
Tá róil éagsúla ag próitéin XCL12 agus a ghabhdóir ceimicín CXC (CXCR4 agus CXCR7) i iomadú, fás, imirce agus ionradh cealla ailse (Wu et al., 2015). Tá na gabhdóirí ceimiceacha seo bainteach le forbairt TNBC trí chonairí comharthaíochta iolracha i samhlacha in vivo agus in vitro araon (Wu et al., 2015). Ina theannta sin, tá baint ag gníomhachtú CXCR4 agus CXCR7 le so-ghabhálacht níos mó do mheastáis agus drochphrognóis i TNBC (Karn et al., 2022). Dá bhrí sin, d'fhéadfadh cnagadh amach CXCR4 agus CXCR7 a bheith ina ngéinte sprice drugaí éifeachtacha chun ailse chíche a chóireáil, lena n-áirítear TNBC. Staidéar le Yang et al. Bhain Yang et al (2019) úsáid as CRISPR/Cas9 chun na géinte CXCR4 agus CXCR7 a chomh-chnagadh amach agus fuarthas amach go raibh iomadú, fás, imirce agus ionradh TNBC curtha go suntasach i leataobh (Yang et al., 2019).
Breathnaíodh leibhéil mhéadaithe miR-3662, oncogéin TNBC, i bhfíocháin ailse chíche (Yi et al., 2022). Léiríodh go gcuireann cnagadh síos miR-3662 cosc ​​ar fhás agus ar mheatastáis meall ailse chíche in vivo agus in vitro araon (Agarwal agus Gupta, 2021). Is coscaire cumhachtach ar chomharthaíocht Wnt/-catenin é HBP-1 agus is dócha gurb é atá freagrach as fás cealla TNBC atá faoi thionchar miR-3662. Le déanaí, fuair Yi et al. amach go rialaíonn ais miR-3662-HBP1 an cosán comharthaíochta Wnt/-catenin i gcealla TNBC (Yi et al., 2022). Mar gheall ar a léiriú meall-shonrach, d'fhéadfadh miR-3662 a bheith ina sprioc teiripeach ionchasach do TNBC. Dá bhrí sin, d'fhéadfadh cnagadh síos miR-3662 faoi thionchar CRISPR/Cas9 a bheith ina chur chuige den scoth chun drugaí nua a fhorbairt le haghaidh cóireáil TNBC.
Is núicléafosfrópróitéin 300 kDa é UBR5 atá aitheanta mar rialtóir lárnach ar siadaiginéis, meiteastáis, agus freagairt imdhíonachta i réimse ailse (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Tuairiscíodh go bhfuil UBR5 suasrialaithe go mór i samplaí TNBC agus go spreagann sé feidhm ERα trí iomadú a spreagadh trína ghníomhaíocht ubiquitin ligase (Bolt et al., 2015). Léirigh staidéir seicheamhúcháin exome iomlána ar shamplaí TNBC príomhúla méadú ar léiriú UBR5 freisin, rud a thugann le fios a ról i bhforbairt TNBC. Ina theannta sin, léirigh scriosadh UBR5 faoi thiomáint CRISPR/Cas9 cosc ​​suntasach ar mheiteastáis agus ar fhás TNBC i samhlacha luch turgnamhacha. Thairis sin, d'athbhunaigh cuimsiú UBR5 i samhail luch cineál fiáin a fheidhmiúlacht iomlán, ach níor breathnaíodh an éifeacht seo i sraitheanna sóchánacha neamhghníomhachtaithe (Liao et al., 2017). Tá easpa UBR5 bainteach le méadú ar apoptosis, neacróis, agus cosc ​​ar fhás meall i TNBC mar gheall ar dhroch-angiogenesis. Mar gheall ar chailliúint UBR5, laghdaítear scaipeadh meall chuig orgáin i bhfad i gcéin, agus spreagann UBR5 EMT neamhghnácha den chuid is mó trí laghdú a dhéanamh ar léiriú E-cadherin (Zhang agus Weinberg, 2018). Le déanaí, léiríodh gur fachtóir an-tábhachtach é UBR5 i dtrascríobh PDL1 spreagtha ag IFN-γ i TNBC mar gheall ar a easpa gníomhaíochta ubiquitination E3. Léirigh anailís trascríbhinní RNA go bhféadfadh éifeachtaí sistéamacha a bheith ag UBR5 ar ghéinte a bhaineann leis an gcosán IFN-γ agus trasghníomhachtú PDL1 a chur chun cinn trí leibhéil ghníomhachtaithe RNA kinase próitéine (PKR) agus a thrasduchtóirí agus a ghníomhachtaitheoirí comhartha a mhéadú. trascríobh 1 (STAT1) agus fachtóir rialála interferon 1 (IRF1). Mar sin féin, bíonn éifeacht theiripeach sineirgisteach níos fearr ag baint úsáide as abláisiú comhcheangailte UBR5 agus léiriú PD-L1 trí CRISPR/Cas9 ná mar a bhíonn ag ceachtar bac leo féin, agus bíonn éifeachtaí móra aige ar mhicri-thimpeallacht an meall (Wu et al., 2022). Dá bhrí sin, d'fhéadfadh CRISPR/Cas9 a bheith ina uirlis thábhachtach chun feidhm UBR5 a chosc, rud a chuireann cosc ​​ar mheastáis TNBC agus ar fhás meall.
Is próitéin trasmembrane de chineál I é ROR1 a chuirtear in iúl le linn ailse agus forbairt suthach agus atá aitheanta mar phróitéin oncofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Tá iompar ionrach ailse dhaonna éagsúla bainteach le huasrialú ROR1. Tá torthaí geallta faighte ó staidéir in vivo agus in vitro a bhaineann le comhdhúile teiripeacha a dhíríonn ar ROR1 (Chien et al., 2016). Tá leibhéil arda mRNA ROR1 i mbithóipsí fíocháin chíche bainteach freisin le meall cíche ionsaitheacha cosúil le bonn (BL) agus a n-imirce go codanna eile den chorp. Thairis sin, tá ró-léiriú ROR1 aitheanta mar mharcóir prognóiseach d'fhorbairt TNBC (Chien et al., 2016). Mar sin féin, bheadh ​​​​sé ina straitéis éifeachtach ROR1 a thostú ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 chun fás agus meiteastáis TNBC a chosc.
Baineann an próiseas sialailithe le haigéad sialach a chur le gliocó-chonjugáití, rud a chatalaítear le sialailtransferases (STanna). Baineann ST8SIA1 leis an teaghlach ST agus tá ról tábhachtach aige i bpaitiniginéis galair éagsúla amhail leoicéime limficíteach agus ailse cholaireicteach (Chang et al., 2018). Léiríonn anailís seicheamh RNA go bhfuil ST8SIA1 léirithe go hard i bhfíochán cíche othar TNBC agus go bhfuil comhghaol dearfach aige le sócháin sa ghéin coisctheach meall p53, rud a d'fhéadfadh cur le paitiniginéis TNBC (Battula et al., 2017). Ina theannta sin, tá ST8SIA1 páirteach i meiteastáis agus athfhillteach TNBC, rud a thugann le fios go bhfuil ról tábhachtach aige i dtarlú agus i bhforbairt TNBC. I samhail in vitro de TNBC, léiríodh go gcuireann cnagadh síos ST8SIA1 ag CRIPSR/Cas9 bac ar fhás agus ar mheiteastáis (Battula et al., 2017). Tugann sé seo le fios gur uirlis thábhachtach é CRISPR/Cas9 chun feidhm an oncogene ST8SIA1 a chosc i gcóireáil TNBC.
Is einsím meitibileach é NAT1 a chatalaíonn foirmiú comhdhúile xenóbiotacha céim II agus a chuirtear in iúl i mbeagnach gach fíochán daonna. Is féidir le NAT1 an comhfhachtóir fóláit a úsáid chun aicéitil-CoA (aicéitil-CoA) a spriocdhíriú fiú in éagmais an tsubstráit aimín aramataigh (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Léirigh staidéir go rialaíonn NAT1 feidhm maitrís metalloproteinase 9 (MMP9) i samhlacha cealla ailse chíche agus go gcosnaíonn sé i gcoinne speiceas ocsaigine imoibríoch (ROS) le linn easpa glúcóis (Wang et al., 2018). Léiríodh go gcuireann scriosadh NAT1 cosc ​​ar an gcoimpléasc pyruvate dehydrogenase, rud a fhágann mífheidhm mitochondrial (Wang L. et al., 2019). Ina theannta sin, léirigh tuarascálacha éagsúla eile gur féidir le cosc ​​NAT1 ag baint úsáide as móilíní beaga agus tostú siRNA ionrachas agus iomadú cealla ailse chíche a laghdú (Stepp et al., 2018). Le déanaí, úsáideadh CRISPR/Cas9 chun NAT1 a chosc i líne cealla ailse chíche MDA-MB-231, rud a théann i bhfeidhm ar mheitibileacht cheallach ag brath ar a leibhéal léirithe. Léirigh an staidéar seo freisin go bhfuil NAT-1 ríthábhachtach do dhul chun cinn agus do mheiteastáis TNBC (Carlisle et al., 2020).
Rialaítear trascríobh comhordaithe oncogéine ag sár-fheabhsaitheoirí, fachtóirí trascríobh agus comhfhachtóirí (Hnisz et al., 2015). Ina theannta sin, tá grúpa cínáisí atá ag brath ar chiclin (CDKanna), amhail CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, agus CDK13, riachtanach le haghaidh rialáil trascríobh. Ina measc, tá CDK7 páirteach i bhfosfaraileadh polaiméaráise RNA II, rud atá an-tábhachtach chun trascríobh oncogéine a thionscnamh agus a leathnú i bpaitigineas TNBC. I staidéar ceannródaíoch, chuir scriosadh CDK7 le CRISPR/Cas9 cosc ​​ar TNBC, rud a léiríonn go bhfuil patigineas TNBC ag brath ar CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Léirigh staidéir gur féidir le sócháin i MYC agus RBP (próitéin cheangailteach RNA) aipeaptóis a bheith mar thoradh orthu, ach nach mbíonn tionchar ag sócháin géine aonair i MYC nó RBP ar fhás cealla ailse (Einstein et al., 2021). Rinneadh scagadh ar níos mó ná 1000 RBP sa ghéanóm daonna ag baint úsáide as leabharlann bunaithe ar CRISPR/Cas9. Ina measc, fuarthas amach go raibh 57 RBP ríthábhachtach d’fhás cealla ailse a raibh leibhéil MYC an-ard acu (Wheeler et al., 2020). Ina theannta sin, tá YTHDF2 tábhachtach chun fás cealla TNBC a chothabháil agus laghdaíonn sé méid na dtrascríbhinní meitile le linn trascríobh agus aistriúcháin ardleibhéil i gcealla ailse a bhfuil léiriú MYC níos airde acu. Ina theannta sin, níl YTHDF2 riachtanach do chealla ailse, atá níos lú spleách ar leibhéil MYC arda chun marthanacht othar TNBC a fhadú (Einstein et al., 2021), rud a thugann le fios gur sprioc theiripeach ionchasach é do dhrugaí ar féidir leo TNBC a shárú.
Is ionann próitéiní méire since (ZNFanna) agus thart ar 1% de ghéanóm iomlán an duine. Léirigh staidéir gur féidir le ZNF iomadú cille a rialáil i réimse leathan ailse, amhail ailse ae, ailse chíche agus ailse cholaireicteach (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Baineadh úsáid as leabharlanna a ghintear trí CRISPR knockout chun géinte éagsúla coisctheacha meall (TSGanna) a scagadh i gcealla ailse chíche (Shalem et al., 2014). Ó shin i leith, léirigh staidéar trascríbhinneomach ar chealla ailse chíche scriosta le CRISPR/Cas9 ZNF319 gur géin coisctheach meall é ZNF319 a laghdaíonn iomadú ailse chíche agus dá bhrí sin go bhfuil baint aige le meicníochtaí comharthaíochta éagsúla agus feidhmeanna bitheolaíocha eile (Wang L. et al., 2022).
Is cineál báis cille cláraithe é ferroptóis atá ag brath ar láithreacht iarainn. Is eol go mbíonn tionchar ag láithreacht sárocsaídí lipid ar fhorbairt ferroptóis. Ina theannta sin, tuairiscíodh go léiríonn PKCβII sárocsaídiú lipid luath, agus go bhfuil baint ag méadú ar sárocsaídiú lipid le ferroptóis. Léirigh scagadh ar leabharlann de choscóirí cínáis atá faoi thionchar CRISPR/Cas9 go bhfuil PKCβII páirteach i bpróiseas sárocsaídiú lipid, atá ríthábhachtach do ferroptóis i gcealla MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Dá bhrí sin, tugann sé seo le fios gur féidir le cnagadh amach PKCβII ag CRISPR/Cas9 a bheith ina sprioc géine coisctheach meall féideartha chun galair a bhaineann le ferroptóis a chóireáil (Zhang et al., 2022).
Creidtear gurb í friotaíocht drugaí is cúis le thart ar 90% de bhásanna in othair ailse agus gurb í ceann de na príomhdhúshláin i gcóireáil ailse í (Bukowski et al., 2020). Léiríonn na torthaí go bhfuil líon leordhóthanach géinte a bhaineann le heise-sreabhadh drugaí, deisiú DNA, aipeaptóis agus conairí comharthaíochta cealla éagsúla bainteach le friotaíocht drugaí (Haider et al., 2020). Ina measc, tá roinnt géinte spriocdhírithe ag uirlisí CRISPR/Cas9 agus tá torthaí geallta léirithe acu maidir le friotaíocht drugaí a laghdú agus éifeachtacht cóireálacha frith-ailse a mhéadú (Vaghari-Tabari et al., 2022). Ina theannta sin, tá leabharlanna scagthástála cnagadh amach géine CRISPR/Cas9 ard-táirgeachta bainteach le modhnú feidhm spriocanna géine friotaíochta drugaí féideartha (Shalem et al., 2015). Chun géinte frithsheasmhachta paclitaxel a aithint, úsáideadh seicheamhú RNA in éineacht le scagadh leabharlainne sgRNA ar fud an ghéanóim chun ocht ngéin iarrthóra a aithint, lena n-áirítear histone deacetylase 9 (HDAC9), a bhfuil baint acu le friotaíocht drugaí in othair a bhfuil TNBC athfhillteach orthu (B et al., 2020). I staidéar eile, breathnaíodh méadú ar léiriú diserine/threonine agus tyrosine protein kinase (DSTYK) le linn marthanacht othar TNBC a ndearnadh cóireáil orthu le drugaí frithailse. Thairis sin, fheabhsaigh cnagadh DSTYK faoi mheán CRISPR/Cas9 apoptosis cealla ailse atá frithsheasmhach in aghaidh drugaí go suntasach in vitro (cealla SUM102PT agus cealla MDA-MB-468) agus samhail TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Cé go mbíonn gníomhachtú neamhghnácha ar chonair MAPK ag TNBC, tá droch-éifeacht chliniciúil na dteiripí atá dírithe ar MEK. Léirigh scagadh leabharlainne geanómach CRISPR/Cas9 go ndéanann cosc ​​ar PSMG2 (chaperone tionóil próitéis 2) cealla TNBC BT549 agus MB468 a íogrú don choscóir MEK AZD6244. D'athraigh leagan síos PSMG2 CRISPR/Cas9 feidhm gnáth-phróitéisóim, rud a d'fhág go raibh dí-thionól PDPK1 faoi stiúir uath-phagy, rud a fheabhsaigh cealla meall i samhlacha lucha TNBC arna spreagadh ag AZD6244 (coscaire MEK) agus MG132 (coscaire próitéisóim). Dá bhrí sin, is féidir coscóirí próitéisóim agus MAP kinase (MEK) a riaradh go sineirgisteach chun iomadú cealla meall a laghdú (Wang X. et al., 2022).
Baineadh úsáid as CRISPR/Cas9 freisin chun scagadh a dhéanamh ar chailliúint feidhme géine as a dtagann friotaíocht TNBC (Shu et al., 2020). Mhínigh Ge et al meicníocht friotaíochta drugaí cealla ailse a ndearnadh cóireáil orthu le JQ1, coscaire brómadomain BET (BBDI), i TNBC. Agus CRISPR/Cas9 á úsáid acu, fuair siad amach gur fhág scriosadh an ghéin rb1 go raibh TNBC frithsheasmhach in aghaidh an druga frithailse JQ1. Dá bhrí sin, tá feidhm rb1 tábhachtach sa fhreagairt ar dhrugaí JQ1 i TNBC. Thuairiscigh siad freisin gur coscaire CDK4/6 kinase/microtubule é paclitaxel, agus go bhféadfadh a chomhcheangal le BBDIanna amhail JQ1 freagairtí teiripeacha geallta a sholáthar do TNBC atá frithsheasmhach in aghaidh drugaí (Ge et al., 2020).
Tuairiscíodh gurb é tírdhreach trascríobhach RNA fada neamhchódaithe (lncRNA) is cúis le friotaíocht in aghaidh teiripe neoadjuvant i TNBC. Léiríonn an staidéar seo go bhfuil cúig thrascríbhinn éagsúla de lncRNA MALAT1 léirithe go hard i TNBC. Ina theannta sin, mhéadaigh scriosadh MALAT1 trí CRISPR/Cas9 íogaireacht cealla TNBC BT-549 do paclitaxel agus doxorubicin, rud a thugann le fios go bhféadfadh ról a bheith ag friotaíocht MALAT1 i TNBC (Shaath et al., 2021).
Tá sócháin i BRCA1 (BRCA1m) ilchineálach agus dá bhrí sin deacair a bhrath. Féadfaidh spriocdhíriú ar PARP1 (polaiméaráis pola(ADP-ribose)), an comhpháirtí marfach sintéiseach de BRCA1, íogaireacht cheimiceáin drugaí TNBC a mhéadú. Agus CRISPR/Cas9 á úsáid, mhéadaigh scriosadh PARP1 íogaireacht drugaí frithailse amhail doxorubicin, gemcitabine agus docetaxel do chealla TNBC sóchánacha mBRCA1, rud a thugann le fios go bhfuil PARP1 páirteach i bhfriotaíocht drugaí i TNBC freisin (Vaghari-Tabari et al., 2022). Is eol go méadaíonn sócháin sna géinte coisctheacha meall BRCA1 nó BRCA2 an dóchúlacht go bhforbrófar ailse chíche i ndaoine. Éilíonn cóireáil na n-othar seo úsáid coscairí PARP. Ina theannta sin, tá sé léirithe gur féidir le cnagadh amach an fhachtóra tarrthála núicléatíde DNPH1 ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 an monafosfáit núicléatíde tocsaineach 5-hiodrocsaimeitildeocsaiúiridín (hmdU) a bhaint, rud a fheabhsaíonn freagairt cealla atá easnamhach i BRCA ar íogaireacht do choscóirí PARP (Fugger et al., 2021). Dá bhrí sin, d'fhéadfadh coscóirí CRISPR/Cas9 agus PARP1 a bheith ina straitéis chóireála thábhachtach do TNBC.
Is géin friotaíochta ildrugaí é an géin glicphróitéine treáiteach (P-gp) a bhíonn suasrialaithe go ginearálta i thart ar 41% de na TNBC uile (Sun et al., 2020). Aithníodh eis-sreabhadh drugaí spreagtha ag P-gp mar rialtóir lárnach ar fhriotaíocht drugaí in ailse chíche. Léirigh coscairí P-gp íogaireacht mhéadaithe do dhrugaí frithailse in ailse chíche (Famta et al., 2021). Dá bhrí sin, d'fhéadfadh abláisiú nó cosc ​​P-gp agus coscairí P-gp, trí mheán CRISPR/Cas9, a bheith ina modhanna an-tábhachtacha chun friotaíocht drugaí i TNBC a shárú.
Is eol go mbíonn friotaíocht drugaí mar thoradh ar iompróir caiséad ceangailteach ATP G2 (ABCG2) i dTNBC (Palasuberniam et al., 2015), cé nach bhfuil aon tuairiscí ann faoi láthair ar an ngaol idir tostú CRISPR/Cas9 agus ABCG2 agus díghníomhachtú géine coscairí meall. Féadfaidh PTEN gníomhachtú ABCG2 a fheabhsú (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Dá bhrí sin, d’fhéadfadh sé gur cóireáil oiriúnach í CRISP/Ca9 a úsáid chun ABCG2 a bhaint agus é a chomhcheangal le coscaire ABCG2 chun friotaíocht drugaí i TNBC a shárú. Luann Tábla 2 CRISPR/Cas9 ag díriú ar gach géine friotaíochta.
Tábla 2. Díríonn CRISPR/Cas9 ar ghéinte éagsúla frithsheasmhachta TNBC chun cealla a íogrú do dhrugaí frithailse.
Is uirlisí féideartha iad leabharlanna CRISPR/Cas9 chun scagadh a dhéanamh ar mhútáin ghéine a bhaineann le paitigineas ailse (Chan et al., 2022). Baineann ceithre chéim leis an modh scagtha seo amhail (a) tógáil leabharlainne, (b) trasduchtú lionsavíreasach, (c) scagadh feinitíopach, agus (d) anailís géine sprice. Cé go bhfuil gníomhachtú neamhghnácha ar an gconair MAPK ag TNBC, tá an prognóis chliniciúil maidir le teiripe spriocdhírithe MEK d'othair TNBC a bhfuil mútáin i ngéinte coisctheacha meall amhail PTEN, RB1, agus TP53 an-lag.
Ina theannta sin, rinneadh tástáil ar an mhóilín is cumhachtaí agus is roghnaíche, díhidreacatrol, atá flúirseach i sleachta bláthanna agus duilleoga Guatamala, i scagadh cnagtha géine ag baint úsáide as CRISPR/Cas9, chun tuiscint a fháil ar éifeacht díhidreacatrol ar MDA-MB-231. Meicníochtaí cíteatocsaineachta cille roghnacha. Saintréithe gasachta meiseinceimeacha fochineálacha TNBC. Léirigh an scagadh seo bunaithe ar CRISPR/Cas9 freisin go bhfuil HSD17B11, géin a ionchódaíonn 17β-hiodrocsaistéaróideach díhiodráitéas cineál 11, léirithe go hard i gcealla MDA-MB-231 agus go mbíonn díhidreafalcarinol sonrach do chealla MDA-MB-231 mar thoradh air (Grant et. al., 2020). Dá bhrí sin, tugann sé seo le fios go bhfuil acmhainneacht mhór ag scagadh géanómach CRISPR/Cas9 chun na meicníochtaí atá mar bhunús le hairíonna frithailse comhdhúile nádúrtha féideartha a aithint.
Ina theannta sin, rinneadh staidéar ar leochaileacht TNBC don ailse ag baint úsáide as scagadh CRISPR/Cas9 in vivo neamhchlaonta ar fud an ghéanóim, a léirigh nasc idir conairí oncogineacha agus coscóirí meall. Tuairiscíodh go bhfuil róil thábhachtacha ag príomhchodanna de na conairí mTOR agus Hippo i rialáil meall i TNBC. Ina theannta sin, léirigh staidéir go gcuireann cosc ​​cógaseolaíoch ar oncophróitéin mTORC1/2 agus YAP cosc ​​​​éifeachtach ar phataigineacht TNBC ag baint úsáide as samhail sineirgíochta drugaí-maitrís in vitro agus xenografts díorthaithe ó othair in vivo. Thairis sin, feabhsaíonn cosc ​​mTORC1/2 atá idirghabhálaithe ag Torin-1 macrapinocytosis, ach bíonn bás cille TNBC mar thoradh ar chosc YAP spreagtha ag veirteaporfin. Le chéile, leagann na torthaí seo béim ar chumhacht agus ar láidreacht scagthástála CRISPR in vivo ar fud an ghéanóim chun cóireálacha nua agus éifeachtacha a aithint do TNBC (Dai et al., 2021).
Is fachtóir tábhachtach i nginéis meall é mírialú an chórais imdhíonachta. Seachnaíonn cealla ailse imréiteach imdhíonachta trí mheicníochtaí cosanta a sheachbhóthar, lena n-áirítear cur isteach ar ghníomhaíocht cealla imdhíonachta sa mhicri-thimpeallacht meall agus an córas imdhíonachta a chur i mbaol. Dá bhrí sin, d'fhéadfadh córas imdhíonachta feabhsaithe a fhorbairt a bheith ina chur chuige ríthábhachtach chun meall a chomhrac. Tugann úsáid mhodhnú géine bunaithe ar CRISPR/Cas9 aghaidh ar roinnt saincheisteanna a bhaineann le mífheidhm imdhíonachta ó pheirspictíochtaí éagsúla. Baineadh úsáid as CRISPR/Cas9 chun díolúine frith-meall i gcoinne ailse chíche a fheabhsú trí na conairí seo a leanas (Fíor 3).
Fíor 3. Díríonn imdhíoneolaíocht CRISPR/Cas9 ar chealla TNBC. Neartaíonn cailliúint CDK5 agus leagadh PDL1 agus CD155 an córas imdhíonachta. Mar an gcéanna, mhéadaigh cailliúint A2AR agus leagadh TAAanna amhail HER2, mucin 1 agus TEM8 éifeachtúlacht cealla CAR-T maidir le cealla ailse a mharú. Léirigh scagthástáil cealla T faoi thiomáint CRISPR/Cas9 go bhfeabhsaíonn cur isteach ar chináis p38 gníomhaíocht frith-meall cealla T. Méadaíonn cealla T atá modhnaithe ag CRISPR/Cas9 léiriú TCR (gabhdóir cealla T), rud a fhágann go mbíonn gníomhaíocht frith-meall ag cealla T.
Is é cuspóir na himdhíoneolaíochta an córas imdhíonachta a spreagadh chun ionsaí a dhéanamh ar chealla ailse. De ghnáth, cuireann ró-léiriú próitéiní seicphointe imdhíonachta cosc ​​ar imoibrithe uath-imdhíonachta ach d'fhéadfadh sé cabhrú le hailse iad a sheachaint (Topalian et al., 2015). Cuireann na próitéiní seo cosc ​​ar imoibrithe imdhíonachta trí cheangal le gabhdóirí ar dhromchla cealla imdhíonachta. Díríonn ilphróitéiní seicphointe (mar shampla CD155 agus PD-L1) ar an ngabhdóir PD-1 ar chealla imdhíonachta agus léirítear iad in ailse chíche, go háirithe TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Is féidir le cnagadh síos PD-L1 nó a ghabhdóra ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 an córas imdhíonachta a spreagadh chun ionsaí a dhéanamh ar siadaí TNBC (Yahata et al., 2019). Ina theannta sin, tá sé léirithe go gcuireann síosrialáil léiriú PD-L1 trí scriosadh CDK5 atá idirghabhálaithe ag CRISPR/Cas9 cosc ​​ar fhás meall in vitro agus in vivo (Deng et al., 2020). Tugann cosc ​​fáis i samhlacha in vitro agus in vivo ailse chíche le fios go bhféadfadh éifeacht theiripeach a bheith ag laghdú CD155 atá á mheánú ag shRNA ar ailse chíche (Gao et al., 2018).
Cuireann cealla T CAR CARanna in iúl a aithníonn antaiginí a bhaineann le meall (TAAnna) agus is féidir leo próitéiní seicphointe a úsáid chun a ngníomhaíocht a fheabhsú (Li C. et al., 2020). Tá spriocanna éagsúla féideartha ann do theiripe cealla T CAR in ailse chíche, lena n-áirítear roinnt TAnna amhail HER2, mucin1, agus TEM8 (Bajgain et al., 2018). Tá fianaise ann go bhfuil cealla T CAR atá ag díriú ar mheisiteilin (ró-léirithe i gcealla TNBC BT-459) níos éifeachtaí i gcoinne ailse nuair a chuirtear PD-1 amach ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Mar sin féin, is próiseas dian saothair agus am-íditheach é cealla T a leithlisiú ó othair agus ansin iad a chur in eagar ex vivo. Cé gur féidir le cealla T uilíocha riachtanais leithlisithe a laghdú, ba cheart cealla T deontóra a chuireann antaigin leukocyte daonna (HLA) rang I agus gabhdóir cealla T (TCR) in iúl a bhaint chun neamhghnáchaíochtaí graft-versus-host a chosc (Ren et al., 2017, 2017a). Le CRISPR/Cas9, is féidir le HDR TCR agus HLA a dhíchur ag an am céanna agus an géin a chódálann CAR a dhíchur. Léirigh staidéir gur féidir CRISPR/Cas9 a úsáid chun CARanna frith-CD19 a thabhairt isteach sa lócas TCR, rud a fhágann go dtáirgtear CARanna go héifeachtúil gan cealla T a ídiú (Dimitri et al., 2022). Forbraíodh teicneolaíochtaí ilphléacs chun cealla T CAR allógéineacha a ghiniúint trí TCR, béite-2-micreaglóbailin (B2M), fo-aonad HLA-I agus próitéiní eile ar nós PD-1 agus CTLA-4 a dhíchur ag an am céanna, a bhféadfadh airíonna frith-ailse níos fearr a bheith acu i gcoinne TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
D’fhéadfadh úsáid CRISPR/Cas9 feabhas a chur ar éifeachtacht cealla CAR-T. Is eol go bhfuil airíonna imdhíon-choscacha ag adenosine agus gur féidir leis díolúine frithailse a laghdú trí fheidhm cealla T a bhac agus gabhdóirí adenosine A2A (A2AR) a ghníomhachtú (Vigano et al., 2019). Feabhsaíodh éifeachtúlacht cealla CAR-T in vivo go suntasach trí A2AR a thostú ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 (Giuffrida et al., 2021). Is eol go léiríonn cealla T tréithe feinitíopacha éagsúla amhail leathnú ceallach, difreáil, strus ocsaídiúcháin agus strus geanómach. Léirigh scagadh cealla T bunaithe ar CRISPR/Cas9 cur isteach ar 25 cínáis gabhdóra cealla T éagsúla. Ina measc, tá sé léirithe go bhfeabhsaíonn scriosadh cínáis p38 gníomhaíocht frith-meall cealla T, rud a léiríonn gur rialtóir lárnach ar rialáil cealla CAR-T é cínáis p38 (Gurusamy et al., 2020).
Is féidir cealla T a mhodhnú go géiniteach ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 chun TCRanna a bhfuil ard-léiriú orthu a tháirgeadh. Léirigh aistriú cealla T modhnaithe go géiniteach chuig othair gníomhaíocht frithailse níos láidre ná cealla T intíre. Dá bhrí sin, féadfaidh TCRanna intíre dul san iomaíocht le TCRanna atá athraithe go géiniteach in othair, rud a d'fhéadfadh tionchar a imirt ar acmhainneacht imdhíonteiripe ailse. Chun an fhadhb seo a shárú, d'fhéadfadh freagairtí imdhíonachta frithailse níos fearr a bheith le feiceáil trí CRISPR/Cas9 a úsáid chun TCR-β intíre a bhaint i gcealla glacadóra agus ina dhiaidh sin cealla T TCR-β a aistriú chuig othair ailse gan gá le hiomaíocht ghnéasach TCR intíre (Fan et al. 2018). Dá bhrí sin, seachas cealla T modhnaithe le CRISPR, tá TCRanna míle uair níos íogaire d'antaiginí meall ná cealla T gnáth-thrasduchtaithe le TCR. Ina theannta sin, i leoicéimí éagsúla, taispeánann cealla T athraithe a ghintear ag γδ TCR+ CRISPR léiriú níos airde de chealla T CD4+ agus CD8+ ná aistriú caighdeánach TCR (Legut et al., 2018). Dá bhrí sin, d'fhéadfadh cealla T modhnaithe a ghintear le CRISPR/Cas9 a bheith ina modh imdhíoneolaíochta éifeachtach chun TNBC a shárú.
Is móilíní greamaitheachta cille iad integrins atá i láthair i dtrasmembranes ceallacha agus a chuireann ceangal cealla leis an maitrís eachtarcheallach (ECM) chun cinn (Hamidi agus Ivaska, 2018). Tá mírialú integrins bainteach le forbairt agus imirce ailse tríd an maitrís eachtarcheallach a athrú, rud a fhágann go marthanann cealla ailse sa scaipeadh fola (Hamidi agus Ivaska, 2018). Moillíonn cnagadh anuas integrin atá idirghabhálaithe ag CRISPR/Cas9 dul chun cinn meall, meiteastáis agus coilíniú i TNBC. Tuairiscíodh go laghdaíonn cnagadh anuas integrin a5 (ITGA5) imirce agus dul chun cinn cille in ailsí eile amhail ailse scamhóg (Ju et al., 2017), rud a thugann le fios gur féidir le integrin a5 a bheith ina phríomhfhachtóir i pataigineas TNBC freisin.
Is próiseas dian saothair, am-íditheach agus neamhéifeachtach é lucha cnagadh amach a ghiniúint ag baint úsáide as modhanna traidisiúnta gaschealla suthacha (ES). Tógann sé míonna agus blianta chun cealla ES a spriocdhíriú trí athchomhcheangal homalógach, lucha chiméireacha a phórú, agus ansin iad a thrasnú le lucha heitrisigeacha chun sliocht homaisigeach a tháirgeadh. Tá trasphórú casta ag teastáil chun lucha a bhfuil il-sócháin ghéiniteacha orthu a chruthú. Mar sin féin, tá go leor fadhbanna tagtha chun cinn agus lucha á n-úsáid a ghintear trí abláisiú cealla ES ag baint úsáide as CRISPR/Cas9 nó trí mhicrea-instealladh comhpháirteanna CRISPR/Cas9 in uibheacha toirchithe aoncheallacha. Mar shampla, is minic a tharlaíonn tabhairt isteach athruithe ag loci dé-ailléileacha agus níl sé sainiúil don ghéin. Tuairiscíodh le déanaí gur féidir le cealla ES ag baint úsáide as teicneolaíocht CRISPR/Cas9 sócháin dé-ailléileacha a chur isteach i suas le 5 ghéin ag an am céanna (Nishizono et al., 2021). Chun na críche seo, rinneadh mRNA Cas9 agus cúig gRNA géin-shonracha a thrasfheistiú ag an am céanna i gcealla ES. Leagann sé seo béim ar ghealladh agus éifeachtacht an nós imeachta seo, cé gur dócha gur tugadh na sócháin seo ar aghaidh nuair a póráladh línte bunaitheora chun lucha cúigfhillteacha a tháirgeadh. Tuairiscítear fionnachtain iontach sa staidéar freisin: níl gá le cealla ES a thuilleadh chun lucha géinmhodhnaithe a chruthú. Ina áit sin, chun táirgí géine sonracha a bhaint, instealladh mRNA agus gRNA Cas9 i suthanna céim aoncheallacha. Mar thoradh air sin, cruthaíodh línte bunaitheora a ndearnadh cnagadh orthu ar féidir iad a úsáid go teoiriciúil chun iarmhairtí scriosadh géine i lucha a staidéar (Qin et al., 2016). Dá bhrí sin, ceadaíonn CRISPR/Cas9 cruthú lucha trasghéineacha chun TNBC a chóireáil ar chostas níos ísle ná innealtóireacht ghéiniteach thraidisiúnta. Ag baint úsáide as an gcóras CRISPR/Cas, forbraíodh samhail nua lucha a ndearnadh cnagadh orthu ar féidir léi sócháin phointe a thabhairt isteach go rathúil i ngéin amháin nó níos mó inchinne i TNBC. Bunaithe ar an gcoincheap seo, is féidir samhlacha ainmhithe de TNBC a fhorbairt freisin ag baint úsáide as scriosadh BRCA1 agus p53 atá idirghabhálaithe ag CRISPR/Cas9, rud a fhágann cailliúint deisiúcháin HR, éagobhsaíocht ghéanómach, agus feinitíopaí sóchánacha (Annunziato et al., 2020).
Faoi láthair, úsáidtear modhanna éagsúla ar nós mamagrafaíocht, íomháú athshondais mhaighnéadaigh (MRI) agus ultrafhuaime chun TNBC a dhiagnóisiú. Mar sin féin, tá roinnt teorainneacha leis na modhanna seo. Úsáidtear mamagrafaíocht chun fíochán cíche áitiúil a dhiagnóisiú seachas meiteastáis, áit a bhfuil cealla ailse tar éis aistriú chuig orgáin eile. Ní modh iontaofa é ultrafhuaime chun TNBC a dhiagnóisiú (Chen agus Lee-Felker, 2023). Tá íogaireacht níos airde ag MRI ná ultrafhuaime agus mamagrafaíocht, ach tá a chruinneas diagnóiseach teoranta (Sha agus Chen, 2022). Is bealach ionrach é bithóipse fíocháin chun cealla ailse a aithint. Mar sin féin, i gcásanna áirithe, d’fhéadfadh bithóipse fíochán ailseach a chailleadh má théann an tsnáthaid ar seachrán ón limistéar spéise. Ina theannta sin, tá sé an-daor agus is féidir go mbeadh sé trámach don othar. Is cineál ilchineálach ailse é TNBC, mar sin ní fhéadfaidh bithóipse dóthain faisnéise a sholáthar faoin gcineál ailse. Dá bhrí sin, tá géarghá le modh nua iontaofa ó thaobh diagnóis de chun TNBC a bhrath. D’fhéadfadh CRISPR/Cas9 a bheith ina rogha eile an-íogair agus íosta-ionrach le haghaidh diagnóis ailse chíche. Chun na críche seo, is féidir straitéisí bunaithe ar CRISPR/Cas9 a úsáid chun modhanna PCR a fheabhsú chun TNBC a dhiagnóisiú. Ar dtús, úsáidtear próitéiní Cas9 agus cpf1 an chórais CRISPR chun DNA neamhshonrach a bhaint, agus ansin is féidir leis an dá phróitéin seo (Cas9 agus cpf1) an seicheamh PAM a aithint sula gceanglaíonn siad leis an DNA sprice (Deepak Singh et al., 2021). Dá bhrí sin, is féidir le PCR sócháin a bhaineann le forbairt ailse a aithint. Tá roinnt staidéar tar éis an straitéis seo bunaithe ar CRISPR a ghlacadh chun sócháin éagsúla in ailsí éagsúla a bhrath (Safari et al., 2019). Dá bhrí sin, féadfaidh modhanna PCR bunaithe ar CRISPR an spleáchas atá ar dhiagnóisiú TNBC ar mhodhanna ionracha amhail imdhíonhistocheimic bunaithe ar bhithóipse a laghdú.
Léiríodh athruithe géinitíopacha i rialáil gabhdóirí hormóin i TNBC freisin (Chen agus Russo, 2009). Is féidir le straitéisí PCR bunaithe ar CRISPR/Cas9 ag baint úsáide as micrea-araí le haghaidh diagnóisic pointe cúraim na sócháin seo a mhonatóiriú go héifeachtach (Hajian et al., 2019). D’fhéadfadh sé faisnéis ábhartha a sholáthar do sholáthraithe cúram sláinte faoi shócháin shonracha in othair TNBC, rud a d’fhéadfadh cabhrú lena gcúrsa cóireála a fheabhsú. Mar sin féin, tá teorainneacha ag baint leis an teicníc chomhcheangailte seo. Dá bhrí sin, tá gá le hiarrachtaí fairsinge taighde sula bhféadfar an modh CRISPR/Cas-PCR seo a úsáid sa chúram sláinte chun TNBC a dhiagnóisiú (Yang et al., 2019).